Поточна цитофлуориметрия - същност и приложение

Поточната цитофлуориметрия е цитологичен изследователски метод, За задълбочен анализ на клетките. Предимството му е, че позволява да се изследва всяка клетка поотделно. Този тест помага да се оценят няколко параметъра в стотици клетки за няколко секунди. Това прави цитофлуориметрията един от най-бързите и най-точните анализи, които понастоящем са на разположение на учените и клиницистите.

Принцип

Принципът на метода на поточната цитофлуориметрия се основава на измерването на разсейването на светлината и луминесценцията (флуоресценцията) на клетките. Клетъчната суспензия преминава като високоскоростен поток през клетката на цитометъра, където се облъчва от лазера. Там се извършва така нареченото хидродинамично фокусиране. Механизмът му се състои в това, че потокът от клетката с изследваните частици на изхода се влива във външна струя, която има по-висока скорост. Резултатът е подреждане на частиците в подредена верига.

Клетките са предварително маркирани със специални флуоресцентни багрила (флуорохроми). Те позволяват на лазерния лъч да произвежда вторична луминесценция. Получените светлинни сигнали се засичат от детектори. След това информацията се обработва с помощта на софтуерни алгоритми, които позволяват да се преброят отделните клетъчни популации, които се различават по определени критерии.

Изследването с традиционна микроскопия често не позволява да се разграничат различните клетки, тъй като те изглеждат еднакво. Цитофлуориметрията може да предостави други данни (структурна цялост на ДНК), експресия на протеини, оцеляване на клетките.

Тъй като за възбуждането на флуорохромите са необходими различни дължини на вълната на светлината и различни видове детектори, съвременните устройства са оборудвани с няколко канала за детекция (от 4 до 30). Броят на лазерните излъчватели може да бъде от 1 до 7. По-сложните устройства позволяват многопараметричен анализ на няколко свойства на частиците едновременно.

Предимства и недостатъци

Предимствата на поточната цитофлуориметрия включват следното:

• Висока скорост на обработка (до 30 000 събития могат да бъдат записани в секунда);
• възможност за изследване на голям брой клетки (до 100 милиона); - по-сложните устройства позволяват едновременно получаване на многопараметрични изображения. в извадката);
• Количествено определяне на интензитета на флуоресценцията;
• анализ на всяка клетка;
• хетерогенни процеси се изследват едновременно;
• автоматично разделяне на данните на клетъчни популации;
• качествена визуализация на резултатите.

Друга характеристика на тази техника е, че анализираната частица се оцветява с няколко флуоресцентни разтвора. Това позволява провеждането на многопараметрично изследване.

Недостатъците включват сложно техническо оборудване и необходимост от специална подготовка на пробите.

Цитометри

Първите устройства от този тип се появяват още през 1968 г. в Германия, но те се разпространяват много по-късно. Понастоящем всички инструменти за поточна цитометрия могат да бъдат разделени на 2 типа:

• Устройства, които измерват флуоресцентна емисия (две или повече дължини на вълната), разсейване на светлината под ъгъл от 10° и 90° (детектор за малък ъгъл и детектор за странично разсейване);
• апарати, които освен че измерват няколко клетъчни параметри, автоматично сортират в групи според тези критерии.

Детекторът за директно разсейване на светлината е предназначен за измерване на размера на клетката, докато устройството за странично разсейване на светлината предоставя информация за наличието на вътреклетъчни гранули, съотношението на обема на цитоплазмата и ядрото.

Класическите цитометри, за разлика от светлинните микроскопи, не позволяват визуализиране на клетката. През последните години обаче са разработени комбинирани устройства, които могат да съчетават възможностите на микроскоп и цитофлуориметър. Те ще бъдат разгледани по-долу.

Визуализиране на цитометри

Една от характеристиките на инструментите, използвани в класическата поточна цитофлуориметрия, е, че ако в популацията от клетки, която се анализира, се регистрират редки събития, няма как да се оцени. Тези частици може да са останки от мъртви клетки или да са рядка група клетки. В конвенционалните апарати тези данни са изключени от общия поток на събитията, но именно те могат да бъдат особено ценни за научен и клиничен анализ.

Ново поколение поточни цитометри, които позволяват заснемане на изображение на всяка клетка, преминаваща през детекторната зона в потока. Това може лесно да се види, като се щракне върху съответната област от графиката, която се показва на компютърния монитор.

области на приложение

Поточна цитофлуориметрия универсален метод, който се използва в много области на медицината и науката:

• имунология;
• онкология;
• трансплантология (трансплантация на червен костен мозък, трансплантация на стволови клетки);
• хематология;
• токсикология;
• Биохимия (измерване на киселинността в клетката, изследване на други параметри);
• фармакология (създаване на нови лекарства);
• микробиология;
• Паразитология и вирусология;
• Океанология (изследвания на фитопланктона за оценка на състоянието на водните басейни и други задачи);
• Нанотехнологии и анализ на микрочастици.

Имунология

Имунната система на човека се състои от голямо разнообразие от клетки. Поточната цитометрия в имунологията позволява анализ на тяхната структура и функция, т.е. морфофункционален анализ.

Подобни проучвания помагат да се изследва сложната природа на имунитета. Клетъчните фенотипове се променят в резултат на активиране на антигени, развитие на патология и други фактори. С цитофлуориметрията могат да се отделят субпопулации от имунни клетки в сложна смес и да се оценят промените им с течение на времето.

Онкология

Една от най-важните задачи в онкологията е диференциацията на клетъчните типове. Принципът на онкохематологичния флоуцитометричен анализ се основава на следното явление: пробата се обработва със специално флуоресцентно багрило, което се свързва с цитоплазмените протеини. След делене в активно пролифериращи клетки съдържанието му намалява наполовина. Съответно интензитетът на луминесценция на клетките намалява наполовина.

Съществуват и други начини за откриване на пролифериращи клетки:

• използване на ДНК-свързващи багрила (пропидиев йодид);
• прилагане на маркиран урацил;
• регистриране на повишени нива на експресия на циклинови протеини, които участват в регулирането на клетъчния цикъл.