Афинитетна хроматография в медицината: характеристики и приложения

Хроматографията е метод за разделяне на вещества. Използва се за последващ качествен и количествен анализ на физичните и химичните свойства на микрочастиците. Вариант на тази техника е афинитетната хроматография. Идеята за разграничаване на белтъчните съединения чрез използване на афинитетното свойство на молекулите е известна в науката от десетилетия. Но тя се развива едва през последните години, след въвеждането на високопорести хидрофилни матрични материали. Тази техника е полезна както за аналитични цели (разделяне и идентификация), така и за препаративни цели (пречистване, концентрация).

Същността

Афинитетната хроматография (от латинската дума affinis, която означава "съседен" или "относителен") се основава на афинитетни взаимодействия, които представляват образуване на високоспецифични връзки между разделяща молекула (лиганд или афинант) и целева молекула. Тези механизми са широко разпространени в природата (свързване на медиатори или хормони и рецептори, антитела и антигени, хибридизация на полинуклеотиди и други видове процеси). В медицината афинитетната хроматография се прилага на практика от 1951 г. насам.

Разделянето на компонентите се извършва по следния начин:

• Работен разтвор, съдържащ веществото, което трябва да се изолира, се пропуска през сорбент;
• Лигандът, отложен върху сорбционната матрица, задържа веществото;
• тя е концентрирана (натрупана);
• Извличане на изолираното вещество от сорбента чрез измиване с разтворител.

Този метод дава възможност за изолиране на цели клетки. Тя се различава от конвенционалната сорбционна хроматография по това, че има силно биоспецифично свързване на изолирания компонент със сорбента, което се характеризира с висока селективност.

Адсорбенти

Следните вещества се използват като адсорбенти:

• Агарозни гелни формулировки на основата на агароза, полизахарид, получен от агар. Трите най-разпространени гела са Сефароза 4В, CL (омрежена агароза) и афи-гел. Последната формулировка е модифициран гел от агароза и полиакриламид. Той е по-биологично инертен, химически и термично стабилен.
• Силикагел.
• Стъкло.
• Органични полимери.

Използват се допълнителни вещества за премахване на механичните бариери пред контакта с лиганда чрез отделянето му от носителя (пептиди, диамини, полиамини, олигозахариди).

Апаратура

Оборудването за афинитетна хроматография се състои от следните основни компоненти:

• Резервоари за съхранение на мобилната фаза (елуент);
• помпи за високо налягане за захранването медии (най-често бутални);
• Филтър за обезпрашаване на елуентите;
• устройство за дозиране;
• хроматографска колона за разделяне на смес;
• Детектор за откриване на отделените компоненти, напускащи колоната;
• Хроматографски записващи устройства и микропроцесорен блок (компютър).

Предварително през мобилната фаза се пропуска хелий, за да се намали количеството на разтворения въздух. За да се променя концентрацията на елуента, се инсталират няколко помпи, управлявани от програматор. Хроматографските колони се изработват от неръждаема стомана (при по-високи изисквания за устойчивост на корозия), стъкло (универсална версия) или акрил. За препаративни цели диаметърът им може да варира от 2 до 70 cm. Микроколони Ø10-150 µm се използват в аналитичната хроматография.

За да се повиши чувствителността на детекторите, към сместа се добавят реагенти, които произвеждат вещества, които са по-абсорбиращи светлината в ултравиолетовата или видимата област на спектъра.

Методология

Разграничават се два основни вида течна афинитетна хроматография:

• Колонен, при който колоната е запълнена с неподвижна фаза и сместа се пропуска през нея с поток от елуент. Разделянето може да се извърши под налягане или по гравитационен път.
• Тънък слой. Поток на елуент чрез капилярна сила през адсорбента. Адсорбентът се нанася върху плоча от стъкло, керамична или кварцова пръчка или метално фолио.

Основен работни стъпки включва:

• Подготовка на адсорбента, фиксиране на лиганда върху носителя;
• Подаване на сместа за разделяне към хроматографската колона
• натоварване на мобилната фаза, свързване на компонента с лиганда;
• Замяна на фазата за отделяне на свързаното вещество.

Цел

Афинитетната хроматография се използва за изолиране на следните видове вещества (видът на използвания лиганд е посочен в скоби):

• Аналози на ензимни инхибитори, субстрати и кофактори (ензими);
• биоорганични вещества с признаци на генетична чуждост, вируси и клетки (антитела);
• Въглехидрати с високо молекулно тегло, монозахаридни полимери, гликопротеини (лектини);
• Ядрени протеини, нуклеотидилтрансферази (нуклеинови киселини);
• рецептори, транспортни протеини (витамини, хормони);
• Протеини, взаимодействащи с клетъчните мембрани (клетки).

Тази техника се използва и за получаване на имобилизирани ензими, а свързването им с целулоза позволява производството на имуносорбенти.

Хроматография на ДНК-свързващи протеини

извличане на ДНК-свързващи протеини чрез хепарин. Този гликозаминогликан е способен да свързва голям брой молекули. Афинитетната хроматография на протеини от тази група се използва за изолиране на вещества като:

• Фактори за иницииране и удължаване на транслацията (синтез на молекули на нуклеинови киселини и протеини)
• рестриктази (ензими, които разпознават специфични последователности в двойноверижната ДНК);
• ДНК лигази и полимерази (ензими, които катализират съединяването на две молекули с образуването на нова химична връзка и участват в репликацията на ДНК);
• инхибитори на серинови протеази, които играят важна роля в имунните и възпалителните процеси;
• растежни фактори: фибробластни, Шванови, ендотелни;
• междуклетъчни матрични протеини;
• хормонални рецептори;
• липопротеини.

Предимства

Методът е един от най-специфичните за изолиране на реактивни съединения (ензими и по-големи агрегати - вируси). Той обаче се използва не само за изолиране на биологично активни вещества.

Откриване на антитела в малки количества, количествено определяне на полиаденилна киселина, експресно определяне на молекулните тегла на дехидрогенази, отстраняване на определени замърсители, изследване на кинетиката на активиране на неактивна форма на трипсин, молекулярна структура на човешки интерферони - това не е целият списък от изследвания, при което афинитетна хроматография. Приложенията в клиниката се дължат на неговите предимства, като например:

• Възможност за ефективно пречистване на протеини, полизахариди и нуклеинови киселини. Малко различни физико-химични свойства и загуба на активност при хидролиза, денатурация и други ефекти, използвани при други методи.
• Бързо разделяне на веществата, динамичен характер на процеса.
• Не е необходимо специално пречистване на ензимите или хомогенизиране на изоензимите за определяне на дисоциационните константи.
• Възможност за разделяне на широк спектър от вещества.
• Нисък разход на лиганди.
• Възможност за разделяне на големи обеми от вещества.
• Обратим процес на свързване на биологични макромолекули.

Тази техника може да се комбинира с други, като се прилага допълнително поле (гравитационно, електромагнитно). Това разширява техническите възможности на хроматографията.

Ензимно инженерство

Този метод даде възможност за активно развитие на нова област на биотехнологиите - ензимното инженерство.

Афинитетната хроматография, прилагана за изолиране на ензими, има следните предимства

• Получаване на ензими в по-големи количества в резултат на по-малко време, което води до по-евтино производство;
• Имобилизирането на ензимите позволява значително разширяване на приложението им в медицината и промишлеността;
• Свързването на ензими с неразтворим твърд субстрат дава възможност за изучаване на микросредата и посоката на реакциите, които играят важна роля в природните и физиологичните процеси.