Рекомбинантна днк: описание, характеристики

Рекомбинантна ДНК са молекули, образувани чрез лабораторни техники за генетична рекомбинация, за да се комбинира генетичен материал от различни източници. Това е възможно, защото молекулите на ДНК на всички организми имат една и съща химична структура и се различават само по последователността на нуклеотидите в нея.

Създаване

Молекулярното клониране е лабораторен процес, използван за създаване на рекомбинантна ДНК. Това е един от двата най-широко използвани метода, заедно с полимеразната верижна реакция (PCR). Тя позволява контрол на репликацията на всяка конкретна ДНК последователност, избрана от експериментатора.

Съществуват две основни разлики между методите за рекомбинантна ДНК. Един от тях е, че молекулярното клониране включва репликация в жива клетка, докато PCR включва репликация в епруветка. Друга разлика е, че първият метод позволява изрязване и вмъкване на ДНК последователности, докато вторият се амплифицира чрез копиране на съществуващи последователности.

ДНК вектор

Получаването на рекомбинантна ДНК изисква вектор за клониране. Той произхожда от плазмиди или вируси и е сравнително малък сегмент. Изборът на вектор за молекулярно клониране зависи от избора на организъм-гостоприемник, размера на клонираната ДНК и от това дали ще се експресират чужди молекули. Сегментите могат да се комбинират чрез различни методи, като например клониране с рестриктаза/лигаза или Gibson Assemblies.

Клониране

В стандартните протоколи клонирането включва седем стъпки.

1. Избор на гостоприемник и вектор за клониране.
2. Получава се ДНК вектор.
3. Формиране на клонирана ДНК.
4. Създаване на рекомбинантна ДНК.
5. Въвеждане на системата в хоста.
6. Подбор на организми, които го съдържат.
7. Избор на клонове с желаните ДНК инсерции и биологични свойства.

След трансплантация в гостоприемника чуждите молекули, съдържащи се в рекомбинантния конструкт, могат да се експресират или не. Експресията изисква преструктуриране на гена, така че да включва последователности, необходими за производството на ДНК. Той се използва от транслационния механизъм на гостоприемника.

Как работи

Рекомбинантната ДНК работи, когато клетката-гостоприемник експресира протеин от рекомбинантни гени. Експресията зависи от това дали генът е заобиколен от набор от сигнали, които дават инструкции за неговата транскрипция. Те включват промотор, рибозомно свързване и терминатор.

Проблеми възникват, ако генът съдържа интрони или сигнали, които действат като терминатори за бактериалния гостоприемник. Това води до преждевременно прекратяване. Рекомбинантен протеин Могат да бъдат третирани неправилно, сгънати или деградирани. Производството му в еукариотни системи обикновено се осъществява в дрожди и нишковидни гъби. Използването на животински клетки е трудно, тъй като много от тях се нуждаят от твърда опорна повърхност.

Свойства на организмите

Организмите, съдържащи рекомбинантни ДНК молекули, имат привидно нормални фенотипове. Техният външен вид, поведение и метаболизъм обикновено не се променят. Единственият начин да се докаже наличието на рекомбинантни последователности е да се изследва самата ДНК с помощта на тест с полимеразна верижна реакция.

В някои случаи рекомбинантната ДНК може да има вредни ефекти. Това може да се случи, когато неговият фрагмент, съдържащ активен промотор, се намира в непосредствена близост до преди това заглушен ген в клетката-гостоприемник.

Използвайте

Рекомбинантната ДНК технология се използва широко в биотехнологиите, медицината и научните изследвания. Нейните протеини и други продукти могат да бъдат намерени в почти всяка западна аптека, ветеринарна клиника, лекарски кабинет, медицинска или биологична лаборатория.

Най-често срещаното приложение е в областта на фундаменталните изследвания, където технологията е важна за повечето съвременни дейности в биологичните и биомедицинските науки. Рекомбинантната ДНК се използва за идентифициране, картографиране и секвениране на гени и определяне на тяхната функция. rDNA сондите се използват за анализ на генната експресия в отделни клетки и в тъкани на цели организми. Рекомбинантните протеини се използват като реактиви в лабораторни експерименти. Някои конкретни примери са.

Рекомбинантен химозин

Съдържащ се в сирището, химозинът е ензим, необходими за производство на сирене. Това е първата генетично модифицирана хранителна добавка, използвана в. Рекомбинантният ензим, произведен по микробиологичен път, структурно идентичен с този от телето, струва по-малко и се произвежда в големи количества.

Рекомбинантен човешки инсулин

Почти напълно замества инсулина, получен от животински източници (напр. свине и говеда), за лечение на инсулинозависим диабет. Рекомбинантният инсулин се синтезира чрез въвеждане на човешкия инсулинов ген в бактерии от рода Eterichium или дрожди.

Хормон на растежа

Предписва се на пациенти, чиято хипофиза генерира недостатъчно количество растежен хормон растежен хормон за за поддържане на нормалното развитие. Преди да се появи рекомбинантният растежен хормон, той се получаваше от хипофизната жлеза на трупове. Тази опасна практика е довела до развитие на болестта на Кройцфелд-Якоб при някои пациенти.

Рекомбинантен фактор на кръвосъсирването

Това е протеин за кръвосъсирване, който се прилага при пациенти с форми на хемофилия с нарушено кръвосъсирване. Те не са в състояние да произвеждат фактор VIII в достатъчни количества. Преди да бъде разработен рекомбинантният фактор VIII, протеинът се произвеждаше чрез обработка на големи количества човешка кръв от много донори. При него съществува много висок риск от предаване на инфекциозни заболявания.

Диагностика на ХИВ инфекция

Всеки от трите теста, които обикновено се използват за диагностициране на ХИВ инфекция, е разработен с помощта на рекомбинантна ДНК. Тестът за антитела използва нейния протеин. С него се открива наличието на генетичен материал на ХИВ чрез полимеразно-верижна реакция с обратна транскрипция. Разработването на теста стана възможно благодарение на молекулярното клониране и анализа на геномната последователност на ХИВ.